经过数百年的人工栽培，西红柿已经是一种重要的经济作物，而且红色是西红柿最主要的外观质量指标，并且红色果实具有较高的营养价值和食用价值。

由于果色是由多个基因调控的，因此如何在番茄果色形成过程中进行精细检测与分级，是一个亟待解决的科学问题。

果肉色泽是由多个重要的遗传因子共同决定的，其中一些重要的调控因子如：rs,nor,Gr,Cnr,Nr,hp,t,Del,Aft,atv,Abg等的变异导致了不同的色泽。

西红柿果皮的色彩比较单一，而且很容易进行分类，通常情况下可以将其分成两种类型：彩色果皮和无色透明果皮。

彩色果皮对无色果皮具有显性作用，由SIMYB12基因所控制，在果实的生长过程中，由于SIMYB12基因不能表达，因此不能在果皮中积累类黄酮。

SIMYB12基因在苹果中的过量表达可使其在苹果中呈彩色，且具有较强的贮运能力。

果实色泽的鉴别方法有目测和仪表两种，直观鉴别法是一种比较典型的、使用方便、基础简单的测色方式，它只适合于那些比较简单的分类。

由于种皮颜色的变化幅度非常大，而且大部分都是连续的，因此直接鉴别法很难受到人类的干扰，很可能会忽视掉某些中间的过渡色，这对于准确的测量、分类和定量的分析是不利的。

仪器测定法则是利用各种设备，把颜色转化成精确的数值，让颜色数值化、具体化和可视化，这种方式操作简单，耗时短，还可以对颜色进行更加准确的测量和分类。

色差仪被用于多种农作物的果皮或果实的色泽的测定，例如樱桃番茄、黄瓜和辣椒等。

随着人们生活质量的提升，鲜红、无色、透明、果皮、果肉的粉色西红柿的需求量越来越大，但有关其色泽的功能性标志及其精确检测方法还鲜有报道。

祝光涛课题组前期工作中，首次发现粉果番茄SIMYB12编码的启动子前4kbp区域有603bp长片段，该片段将导致该区域的遗传变异。

在此基础上，以30个不同品种的番茄为材料，开发相应的基因座，开发相应的基因功能标记。

利用激光光谱法测定果实色泽之间的关联性，实现对果实色泽的快速、精准识别，并探讨果实色泽的判别临界点。

国内外关于SIMYB12单倍体形态调控果实色泽的研究较少，而基于SIMYB12单倍体形态构建的遗传多样性及其在果实色泽形成中的作用机制尚无研究。

在此基础上，以SIMYB12基因上与果实色泽相关的突变位点为切入点，通过构建可重复使用的、可应用于凝胶阻滞实验的、可检测到果实色泽的多个遗传变异的遗传变异，从而建立果实色泽的精确、快速的鉴别方法，为果实色泽的遗传改良及果实色泽的鉴别提供理论依据。

材料与方法

选择泉州市农业科学研究所收集的30份番茄种质资源为供试材料，包括樱桃番茄28份和红色大果番茄2份，命名从编号P1~P30。

参考Saghai-Maroof等人的实验结果，利用CTAB法对番茄幼苗进行了全基因组DNA的提取，用酶标记法测定DNA的含量。

祝光涛对番茄果实色泽基因SIMYB12进行了分析，发现该基因位于第1对
SL2.40ch01:70935936-70938394bp区间，且该区间前4kbp区域有603bp序列丢失。

当前，番茄参照基因组已经升级至SL4.0，根据SIMYB12基因的最新注释，从NCBI官网上下载了SIMYB12基因的最新拼接全基因组。

利用序列比较分析，找出SIMYB12基因与其丢失的10kbp的序列，在丢失的603bp的两边合适的地方，进行引物设计，使其具有适宜的尺寸。

通过Primer-Blast技术和NCBI技术比较，验证引物的专一性，并将其提交给生工上海公司，以验证其专一性。

PCR反应系统（15微升）:1微升的模板DNA,1.5微升的10xbuffer,0.6微升的dNTP,0.6微升的前、后两个引物0.6微升，0.3微升的TaqDNA聚合酶，10.4微升的ddH_2。

PCR方法：在94℃下进行5分钟的PCR处理，结果表明在94℃时，30秒时，在58.6℃时，30秒时，在72℃时，延长时间90秒，共35次；在72℃下延长10分钟。

通过对实验数据的分析，对各引物的PCR退火温度进行了相应的调节，得出了最佳的PCR退火温度。

琼脂糖电泳法：以1.5%的琼脂糖为基底，加入1%的gelred核酸染色剂，将DNA放大后的产品放入BerlowGelDoc胶体成像装置中，对其进行观测和摄影。

对每个样品的扩增条带进行计数，其中较大的条带用1表示，较小的条带用3表示，杂合用2表示，而缺少的资料用0表示。

在一个完全成熟的西红柿中，在一周内以3个点为中心，用色差仪测量出L,a,b,C,h的值，然后求出它们的平均。

每种试材各取3株，每株试材3次，五种色差计的测定结果有各自的含义：L代表黑白通道，0表示黑色，100表示白色。a代表红绿通道，a>0表示颜色偏红，a<0表示颜色偏绿，b代表黄蓝通道，b>0表示颜色偏黄，b<0表示颜色偏蓝。

C是指色泽的饱和性或纯净性，较高的色度性表示色泽较亮，h是一种色彩角度，它是指三种基础色和它们之间的一种过渡色，0度代表着纯红色，120度代表着纯绿色，240度代表着纯蓝色。

结果与分析

利用酶标仪，对提取的番茄种质DNA展开了快速检测，结果显示样品浓度OD26m/OD280nm范围在1.81~1.99，比值低于1.9的样品有10份。

比值高于1.9的样品有20份，平均值为1.92，供试的30份番茄种质DNA提取质量均满足后续常规PCR扩增要求。

从NCBI官网上获取了番茄最近一期全基因组DNA片段，采用比较分析法，确定了其中603个碱基的缺失区域。

使用Oligo7来设计引物，在SIMYB12的上游丢失序列的区域中，使设计产物扩增碎片的尺寸为200~2000bp，此标记适用于在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

本文以SIMYB12为对象，通过对16对引物进行分析，结果表明其中3对引物的扩增结果均不含丢失的序列，且在扩增结果中存在着碎片尺寸上的差别，不能作为鉴别丢失位置的有效方法。

其中5对引物定位在丢失区域中，能够以单一的显性方式检测到丢失的基因，这5对引物都是显性的。

除了A-13的扩增片段较大，检测效果不佳外，其它的都可以很好的检测到果肉的颜色，但是不能很好的分辨出无色的、透明的果肉和丢失的信息。

在这一区域GC的含量较少，使得PCR很难进行PCR，且通常采用普通的反应系统和热处理条件。

以P1、P9、P53个材料为供试材料，在不同的退火温度下，对4对共显性标记进行了检测，结果发现A-10的扩增效果最好，最适合的退火温度是58.6℃，最后将A-10选择为SIMYB12基因的分子功能标记。

在30个材料中，18个材料在克隆到287个bp左右的特异性片段后，经分子生物学分析，这些材料的果皮呈透明状。

其中3个种质在890个bp左右的区域内进行了遗传分析，结果表明该种质具有明显的纯合性，并对种质进行了分子分析，结果表明该种质为彩色种质。

另外9个材料中，分别出现了287个和890个bp的片段，表明该区域存在着一个杂合体，其性状为花色性状。

以30个不同品种为材料，采用色差计对其果色进行了测定，得到了其果色的L,a,b,c,h等指标。

在这两个颜色空间中，通过对果皮颜色进行分析，最后利用三维坐标对Lab进行分析，将b≥45的果分类为彩色果皮，b<45的果归类为透明果皮。

Ch值使用二维坐标分析，将颜色饱和度C>60的分类为彩色果皮，2种数据分析方法的归类结果是相同的。

利用色差计，可以迅速地测定各种果实的色泽，而大多数果实的色泽则可以用Ch测定法进行鉴别。

在被测试的物质中，用肉眼鉴别方法得到18个无颜色的、12个有颜色的；通过分子功能标记分析，获得了18个无颜色、12个有颜色、3个显性、9个杂合种。

根据测定的镉含量，采用色差分析方法对20个无颜色的果实和10个有颜色的果实进行了鉴别。

结果表明，该性状的遗传变异与肉眼观察结果的性状一致，其中28个性状与Ch鉴别结果一致，2个性状不一致，其中P7、P8性状不一致。

P7、P8是一种由SIMYB12基因突变所致的紫红色西红柿，其果实为彩色，但因为含有大量的花青苷，所以果实呈紫黑色。

讨论与结论

我们前期研究发现，SIMYB12的上游有603bp的突变位点，该位点可能会对SIMYB12的功能产生重要影响，是开发InDel的优良位点。

参考祝光涛所发明的InDel分子标志，王仁汉等在32个常用的西红柿试材上证实了2个不能扩大，而在16个小西红柿上证实了正确的结果，其正确率为62.5%。

我们在此基础上，对其进行改造，并对其进行PCR检测，从而进一步提升其检测效率和准确度。

在前期工作中，我们构建的A-10功能性标签在15µL普通反应系统中仍存在着难以放大的问题，后来我们将dNTPs添加至0.6µL，并对其进行了热处理。

当采用53℃时，该方法的准确率可达66.7%，但因该方法中副带数目过多而导致杂合类型的错误，在此基础上将A-10的识别率提升至100%，克服了基因缺失区难以放大的难题。

紫红色西红柿P7、P8受花色苷代谢通路关键酶调控，使其果皮中的花色苷大量累积，从而使其色泽变紫。

不同色泽的西红柿，只有紫红色的色素与色差计所收集到的色素有差异，其他色泽的色素和紫红色色素都是相同的。

在本试验中，供试的2份紫色番茄材料的果皮属于彩色果皮，但是色差仪的Lab或Ch测量值都属于无色透明果皮的标准范围。

由于项目组已搜集到的紫红色西红柿种质均为单色，无法进行该部分比较实验，所以紫西红柿在色泽上的判别，只能依靠常规的视觉判别方法。

在常规情况下，通常采用视觉检测方法来进行简单的识别和归类，然而果实的色泽变化幅度非常大，且大多呈现出连续的特征。

因此，直接鉴别方法很难受到人类的干扰，不适合对果实色泽进行准确的测定和分类，也很容易忽视某些中间的过渡阶段。

在仪器测定方法中，所采用的色差仪具有自身的照明系统，它不会受到外部环境的影响，可以对两种不同的色彩进行精确的测量，并且具有操作方便、无损的优点。

通过对目测法和色差仪鉴定法测量结果与基因型的相符度进行对比，可以看出除了紫色西红柿的基因型与仪表测量法不一致之外，其他的供试西红柿材料中，目测法和仪表测量法测量结果与基因型的检测结果都是一样的。

这说明仪表测量法可以被应用到对非紫色西红柿的测定，并且可以更准确地对不同果皮的颜色进行判断，并对它们进行分类。

SIMYB12的变异位点较多，且各单体型对果色性状的效应也不一致，因此我们利用该603bp的变异位点，设计了一个A-10的功能性分子标记，虽然不能全面反映果实色性状，但可以应用于多数品种。

该项目的实施将为今后开展以果实色泽性状为目标的遗传改良提供重要的理论依据。